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行瘀清热胶囊对大鼠前列腺成纤维细胞增殖及凋亡的影响

首席医学网      2010年12月06日 16:21:59 Monday  
 
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作者:王玺坤1,晏洁2,刘顺会3,刘昆云3,葛秀君1,刘思敏1,钱聚标1,陈燕1    作者单位:(1.广东药学院 临床医学院,广东 广州 510080; 2.广东省地质勘测局 门诊部,广东 广州 510080; 3.广东药学院 生命科学与生物制药学院,广东 广州 510006)

【摘要】  目的观察行瘀清热胶囊对大鼠前列腺成纤维细胞增殖及凋亡的影响。方法 取健康SD大鼠前列腺组织进行成纤维细胞的原代培养并传代增殖,选用第3~6代细胞,制备行瘀清热胶囊含药血清,于酶标仪490 nm波长处测定吸光度(A)值,计算药物对成纤维细胞的相对抑制率,并以流式细胞仪分析行瘀清热胶囊对前列腺成纤维细胞的凋亡率的影响。结果 行瘀清热胶囊能抑制前列腺成纤维细胞增殖;流式细胞仪分析显示行瘀清热胶囊含药血清使成纤维细胞凋亡率增高较为明显。结论 行瘀清热法防治慢性前列腺炎的机制与抑制前列腺组织成纤维细胞增殖、促进成纤维细胞的凋亡有关。

【关键词】  行瘀清热胶囊;大鼠;成纤维细胞;增殖;凋亡

 Abstract:ObjectiveTo investigate the effect of Xinyuqingre capsules on proliferation and apoptosis of prostatic fibroblasts of rats. Methods Serum containing active ingredients of Xinyuqingre capsules was applied to the 3 rd~6 th generation of prostatic fibroblasts of healthy rats . The optical absorbance was determined with ELISA at the wavelength of 490 nm and the relative inhibition ratio was calculated. The effects of Xinyuqingre capsules on the apoptosis index of prostatic fibroblasts were determined by flow cytometer. Results Xinyuqingre capsules could inhibit the proliferation of prostatic fibroblasts of rats,flow cytometric analysis demonstrated that the serum containing active ingredients of Xinyuqingre capsules could increase the apoptosis rate of prostatic fibroblasts of rats. Conclusion The mechanism of Xinyuqingre method to treat chronic prostatitis was related to the inhibition of the proliferation and increasing of apoptosis rate of prostatic fibroblasts.

  Key words:Xinyuqingre capsules;rat;fibroblast; proliferation;apoptosis

  慢性前列腺炎(chronic prostatitis,CP)的发病率高,一直是困扰成年男性的重要疾患之一,临床治疗效果较差[1]。笔者通过多年的临床观察和研究,应用以行气、祛瘀、清热为主的综合疗法治疗CP,取得了较好的效果[2]。为进一步验证行瘀清热法的治疗机理,笔者制备行瘀清热胶囊含药血清,观察行瘀清热胶囊对大鼠前列腺成纤维细胞增殖及凋亡的影响。

  1材料与方法

  1.1材料

  1.1.1动物雄性SD大鼠,体质量(250±25)g,购自广州中医药大学实验动物中心,许可证号:SCXK(粤)2008-0020。

  1.1.2主要药品与试剂行瘀清热胶囊(自制,主要成分: 王不留行30 g, 延胡12 g, 台乌10 g, 莪术12 g,三棱12 g,槐花12 g);前列通瘀胶囊(珠海星光制药有限公司生产,批号:20090304,规格:50粒/瓶,主要成分:赤勺、土鳖虫、桃仁、夏枯草、白芷、黄芪、通草等); DMEM培养基(Hyclone公司,批号:NVCO244);胎牛血清(杭州四季青生物工程公司,批号:090703);胰蛋白酶粉(Biosharp公司,批号:100116,用PBS配成0.25%(φ)的浓度,过滤除菌,分装,-20 ℃保存);二甲基亚砜(DMSO,北京索莱宝科技有限公司);噻唑蓝(MTT,南京卓尔生化技术有限公司)。

  1.1.3主要仪器

  Model-680 酶标仪(美国Bio-Rad 公司);细胞培养箱(美国Thermo公司);SW-CJ-1F型单双面净化工作台(苏州净化公司);EPICS CL流式细胞仪(美国Beckman公司)等。

  1.2方法

  1.2.1行瘀清热胶囊对前列腺成纤维细胞增殖的影响取健康SD大鼠前列腺组织按酶反复消化法[3]进行成纤维细胞的原代培养并传代增殖,实验选用第3~6代细胞。

  1.2.1.1含药血清的制备SD雄性大鼠6只,体质量约250 g。随机分为3组:空白对照组、行瘀清热胶囊组和前列通瘀胶囊组,每组2只。行瘀清热胶囊组灌胃给予行瘀清热胶囊药液,剂量为含生药8 g/kg;前列通瘀胶囊组给予前列通瘀胶囊药液,剂量为4.4 g/kg;空白对照组以等体积生理盐水灌胃,每日2次,连续3 d,于最后1次给药1 h后眼眶取血,分离血清,合并同组血清。

  1.2.1.2行瘀清热胶囊对成纤维细胞增殖的影响取第3代对数生长期的成纤维细胞,浓度为1.0×105个/mL,加入到96孔板,每孔加含细胞的培养液200 μL,培养24 h后,将细胞分为3组,分别加入终浓度为10%(φ)的空白血清、行瘀清热胶囊血清和前列通瘀胶囊血清,每组6个复孔。作用48 h后加入20 μL MTT (2 mg/mL),4 h后弃上清,每孔加入DMSO 200 μL,低速振荡10 min后,于酶标仪490 nm波长处测定吸光度(A)值。计算药物对成纤维细胞的相对抑制率(IR)=(1-给药组A值/对照组A值)×100%。

  1.2.2细胞周期分析铺细胞至6孔板,浓度为4×105个/mL,将细胞分为3组,分别加入终浓度为10%(φ)的空白血清、行瘀清热胶囊血清和前列通瘀胶囊血清。作用48 h后,收集1×106/mL细胞,用PBS洗涤1次后,70%(φ)乙醇固定并分散为单个细胞悬液,-20 ℃保存。上机前,再用PBS洗涤3次,加入50 μg/mL碘化丙啶染色30 min,上流式细胞仪进行细胞周期分析。每排重复3次,取平均值。

  1.2.3统计学处理采用SPSS 11.5统计分析软件。实验结果以(±s)表示,组间比较采用t检验,P<0.05为差异有显著性。

  2结果

  2.1行瘀清热胶囊对成纤维细胞增殖的影响

  各组血清对前列腺成纤维细胞增殖的影响见表1。与空白组相比,前列通瘀胶囊组和行瘀清热胶囊组A值显著下调(P<0.01),提示行瘀清热胶囊、前列通瘀胶囊能显著抑制前列腺成纤维细胞的增殖;但两药物组之间比较,差异无显著性。  表1各组血清对前列腺成纤维细胞增殖的抑制

  2.2流式细胞仪检测细胞凋亡

  流式细胞仪分析显示,行瘀清热胶囊组和前列通瘀胶囊组细胞DNA含量直方图上出现明显的亚二倍体峰(见图1),说明这两组的细胞凋亡率比空白组高。与空白组相比,前列通瘀胶囊组G1期DNA含量增多,而S期、G2/M期含量降低,说明前列通瘀胶囊血清将成纤维细胞阻滞在G0和G1期。行瘀清热胶囊组血清G2/M期DNA含量较空白组明显降低;与前列通瘀胶囊组比较,行瘀清热胶囊组G2/M期DNA含量降低较为明显,说明行瘀清热胶囊组影响成纤维细胞进入G2/M期较明显(见表2),成纤维细胞凋亡率较高。[TPc1841.tif;S*2〗A.空白组; B.前列通瘀胶囊组; C.行瘀清热胶囊组图1流式细胞直方图  Figure 1Flow cytometry histogram in various groups表2各组血清对前列腺成纤维细胞周期分布的影响

  3讨论

  由于导致CP的病因复杂,前列腺解剖特殊,临床上CP以症状复杂、病程迁延、容易复发等为特征,慢性炎症的长期存在使患者前列腺腺体变硬、纤维化,成为“难治性慢性前列腺炎”,现代医药学治疗较难取得满意疗效。临床研究证明中医药治疗可取得较好效果,合理的中医药治疗能够改善CP前列腺的组织病理学改变,如血液流变学、微循环障碍导致的局部充血、局部炎细胞浸润、纤维细胞增生等[4],研究也发现成纤维细胞生长因子在前列腺炎发病中具有重要意义[5],但机理不太明确。目前国内以中医药方法治疗机体脏器纤维化的研究取得了较好的疗效,并向深层次的研究推进[6]。

  CP最常见的症状以排尿障碍和局部坠胀、疼痛或不适为主,下焦湿热症状并不突出;且因失治误治,病久不愈,脾肾两虚,血脉淤滞,均将出现淤证的病理学改变,甚至前列腺纤维性变;局部经络阻隔、气血瘀滞;迁延不愈,积淤又化热(为虚热或虚实夹杂),反复缠绵。故治宜以行气、祛淤、清热为主,目标是改善或防治前列腺的纤维变性。

  本研究结果表明,行瘀清热胶囊能够抑制前列腺成纤维细胞增殖,使大鼠成纤维细胞的凋亡率增高较为明显。行淤清热法防治CP的机理与抑制前列腺组织成纤维细胞增殖、增加成纤维细胞的凋亡有关,可改善患者前列腺的纤维变性状态,特别对于难治性慢性前列腺炎的治疗具有重要的意义。

【参考文献】
   [1] 李宏军. 前列腺炎防治手册[M].北京:中国妇女出版社,2007:11-14.

  [2] 王玺坤. 以行气祛瘀清热为主的综合疗法对CPSI影响的临床研究[J].中医药学刊,2005,23(3):243-244.

  [3] 汤楚华,施生根,牛忠英,等. 酶消化组织块法原代培养人牙周膜成纤维细胞的初步研究[J].中华医学杂志,2004,84(8):656-658.

  [4] 张亚强,刘酞枋. 前列腺方治疗慢性前列腺炎血瘀证的临床与实验研究[J].中国中西医结合杂志,1998,18(9):5345.

  [5] 谢庆祥. 成纤维细胞生长因子在前列腺中的作用[J].国外医学:泌尿系统分册,1996,16:71.

  [6] 李明. 丹参对系统性硬皮病成纤维细胞胶原基因表达的影响[J].中华皮肤科杂志, 1999,32(1):47.

  (责任编辑:幸建华)

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