甲状腺乳头状癌组织CK19的表达及临床病理意义
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首席医学网
2009年05月12日 15:48:40 Tuesday
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作者：史琳，张安文，杨燕初，卓建红，任传伟，罗 宇 作者单位：柳州医学高等专科学校病理学教研室，广西 柳州 545006
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【摘要】 目的：观察甲状腺乳头状癌组织中细胞角蛋白19（CK19）的表达，探讨其在甲状腺乳头状癌发生发展中的作用。方法：用RTPCR和免疫组织化学法检测甲状腺乳头状癌36例,良性甲状腺疾病19例及正常甲状腺组织8例中CK19基因mRNA和蛋白质的表达。结果：CK19基因mRNA和蛋白质表达一致，在甲状腺乳头状癌组与其他非癌组织间的表达差异均具有统计学意义(P<0.05)；CK19基因mRNA在有淋巴转移组的表达水平明显高于无淋巴转移组，差异也具有统计学意义(P<0.05)。结论：CK19基因在甲状腺乳头状癌中表达明显增加且与转移有关，提示CK19可能参与了甲状腺乳头状癌的发生发展过程,并与肿瘤的转移有关。
【关键词】 甲状腺；乳头状癌；细胞角蛋白19（CK19）
甲状腺乳头状癌是甲状腺恶性肿瘤中最常见的一种类型，其诊断主要依据其组织学的乳头状结构和特征性细胞核形态，包括分支细长和粗大的乳头、被覆乳头的细胞为高柱状、毛玻璃样核、核沟、核内胞质包涵体及核的不同程度的异型性。而一些良性病变，如结节性甲状腺肿、滤泡性腺瘤、桥本氏甲状腺炎等疾病常可伴有乳头状增生或毛玻璃样核，因此，增加了甲状腺乳头状癌诊断的难度。细胞角蛋白19（CK19）的异常表达与甲状腺乳头状癌的发生、发展和转移密切相关，可用于区别甲状腺良恶性乳头状增生[1]。但目前国内对CK19在甲状腺病变中的研究多局限于蛋白质水平[2]，为了进一步探讨CK19与甲状腺乳头状癌发生发展的相关性，本试验用RTPCR和免疫组织化学（EnvisionTM）检测甲状腺乳头状癌、甲状腺良性病变及正常甲状腺组织中CK19基因mRNA和蛋白质的表达，以探讨其与甲状腺乳头状癌分化及转移的关系。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 标本来源 抽取广西医科大学第一附属医院和柳州医学高等专科学校附属广西甲状腺疾病专科医院2005年10月至2006年9月经外科手术切除的甲状腺病变标本55例，年龄18岁～73岁，均经病理确诊。其中甲状腺乳头状癌36例、甲状腺腺瘤10例、结节性甲状腺肿6例、桥本氏甲状腺炎3例。36例甲状腺乳头状癌中，淋巴结转移19例、无淋巴结转移17例。另取正常甲状腺组织8例，均以腺瘤旁2cm以外的甲状腺组织为正常组织。所有标本在离体30min内放入液氮冷冻，并立即放入-80℃冰箱冻存，剩余组织经10%福尔马林液固定，石蜡包埋切片。
1.1.2 试剂 Trizol试剂购自美国Invitrogen公司；cDNA逆转录试剂盒购自Fermentas公司；10mmmol/L dNTP、10×PCR缓冲液、Taq DNA聚合酶、25mmmol/L 氯化镁购自CASARRAY公司；DNA Marke购自上海生工公司；琼脂糖购自加拿大BBI公司；用Primer5软件设计复合RTPCR引物，由上海生工公司合成；其他试剂：50×TAE电泳缓冲液、蒸馏水、DEPC、100％乙醇、氯仿、异丙醇、溴酚蓝核酸上样缓冲液、EB等。浓缩型鼠抗人CK19单克隆抗体（即用型）购自上海长岛生物技术有限公司,DAB和Envision试剂盒均购自福州迈新公司。
1.2 方法
1.2.1 RTPCR
1）标本总RNA抽提：Trizol一步法提取组织中的总RNA,在分光光度计上检测A260／280的比值以验证RNA的纯度。
2）逆转录合成cDNA：在20μl体系中用3μg总RNA合成cDNA,反应体系如下:5×buffer 4μl，10×dNTP 2μl，RI 1μl，MMLV 1μl，总RNA 3μg，DEPC水补至20μl。反应条件为42℃ 60min,70℃ 10min,－20℃贮存。
3）PCR扩增：用Primer5软件设计引物, CK19的引物序列如下:上游:5’AGCGGCAGAATCAGGAGTA3’,下游:5’GAGGACCTTGGAGGCAGAC3’,产物为131bp；每例标本均以管家基因GAPDH作为内参照，上游: 5’TCATTGACCTCAACTACATG3’,下游: 5’GCAGTGATGGCATGGACTGT3’,产物为437bp。采用同管扩增。反应体系为12.5μl。反应条件:95℃ 5min，95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 45s,30个循环，72℃ 5min，4℃保存。
4）基因片段序列测定和分析：使用测序仪对PCR产物进行序列测定。将测序结果通过BLAST应用软件与GenBank中的已知序列进行同源性比较相符。
5）PCR产物琼脂凝胶电泳及结果判定：取10μl扩增产物,1μl上样缓冲液,1.7%琼脂糖凝胶电泳(100V,30min)。阴性对照:以ddH2O代替cDNA模板。在紫外灯下观察目的产物,拍照后进行面积灰度扫描,计算目的基因RTPCR产物吸光度容积与βactin基因RTPCR产物吸光度容积之比值,作为目的基因mRNA的相对含量。
1.2.2 免疫组织化学
1）方法：所有标本均做4μm连续切片，作HE和免疫组化染色。按Envision二步法进行免疫组织化学染色，具体操作方法如下：石蜡切片附贴于玻片上，65℃ 1h，常规脱蜡、水化→切片入3%过氧化氢甲醇液内10min，PBS液洗，3min×3次→切片行抗原高压修复处理1.5min，自然冷却20min，PBS液洗，3min×3次→加入一抗，28℃2h，PBS液洗，3min×3次→切片加入第二抗体（Envision），室温（控制在28℃）孵育30min，PBS液洗，3min×3次→切片经DAB显色10min，苏木素衬染4min，梯度乙醇脱水，各3min，封片观察→结果判断。以PBS代替一抗作为阴性对照，以已知阳性片作为阳性对照。
2）CK19免疫组化结果判断：以瘤细胞质内出现棕黄色颗粒为阳性。按阳性细胞数分为：无阳性细胞为阴性“一”；<10％ 为“+”，弱阳性；10％～50％为“++”，中度阳性；>50％ 为“+++”，强阳性。
1.3 统计学处理 采用SPSS13.0统计软件包。数据用±s表示。计量资料采用t检验和方差分析处理。P<0.05为差异具有统计学意义。
2 结 果
2.1 总RNA鉴定 所抽提的总RNAOD260/280值在1.8～2.0，说明RNA提取物纯度较高，完全可以满足RTPCR需要。1％琼脂糖(含EB0.5μg/ml)电泳可见28、18s两条亮带，说明RNA无降解。
2.2 RTPCR检测结果 CK19 mRNA在甲状腺乳头状癌、甲状腺良性病变及正常甲状腺组织中的表达:参照GAPDH基因片段长度为437bp,目的基因CK19片段长度为131bp,两者在甲状腺乳头状癌、甲状腺良性病变及正常甲状腺组织中均有表达,但强度各不相同:CK19 mRNA在甲状腺乳头状癌中表达水平为2.63±2.14，明显高于甲状腺良性病变和正常组织,癌组与非癌组织间差异均有统计学意义(P<0.05)；CK19 mRNA在甲状腺腺瘤、结节性甲状腺肿、桥本氏甲状腺炎及正常甲状腺的表达强度各不相同，分别为0.39±0.22、0.51±0.31、0.52±0.45、1.29±0.58，其中正常甲状腺与腺瘤组、正常甲状腺与结节性甲状腺肿组间差别有统计学意义(P<0.05)。
2.3 免疫组化结果 CK19蛋白质阳性定位于细胞质，呈棕褐色细小颗粒状着色。在甲状腺乳头状癌中表达率为97.2％（35/36），在良性甲状腺病变中极少表达或小灶性弱表达，表达率为5.3％（1/19），两者差异有统计学意义（P<0.01）。CK19蛋白质仅在滤泡性腺瘤中有部分表达10％（1/10）,在结节性甲状腺肿、桥本氏甲状腺炎及正常甲状腺组织中均无表达，各良性病变组与甲状腺乳头状癌组间表达比较差异均有统计学意义（P<0.01）；甲状腺良性病变内部各类型间CK19表达无统计学差异（P>0.05）。
2.4 CK19基因与淋巴结转移 甲状腺乳头状癌有淋巴结转移组19例中,CK19基因mRNA表达水平为3.41±2.63, 无淋巴结转移组17例为1.79±0.97,二者差异有统计学意义(P<0.05)。
3 讨 论
细胞角蛋白属于中微丝蛋白家族，是形成哺乳类动物细胞5种支架成分之一，来源于局部上皮细胞，是上皮细胞骨架的组成部分，表达于正常上皮以及上皮源性原发肿瘤及其转移肿瘤。细胞角蛋白在甲状腺病变中均有表达[3]。CK19是最常见的细胞角蛋白类型之一，是一种低分子量的角蛋白，存在于正常上皮和各种上皮来源的肿瘤中，特别是单层上皮和间皮，成人皮肤、肝细胞和角膜为阴性表达，而子宫上皮、羊膜上皮和间质呈阳性表达。国内外研究认为CK19的过度表达与肺癌、乳腺癌的发生发展有关[4]。最近，何春年等[5]利用自制组织芯片和免疫组化技术联合检测研究发现，CK19在甲状腺乳头状癌组织中表达特异度高，是诊断甲状腺乳头状癌的有价值标记。
本文运用RTPCR和免疫组织化学EnvisionTM法检测甲状腺乳头状癌、良性甲状腺病变和正常甲状腺组织中CK19的表达，结果发现CK19基因mRNA在癌组中100％有表达，且显著高于正常甲状腺、腺瘤、结节性甲状腺肿和桥本氏甲状腺炎，差别均有统计学意义（P<0.05）。CK19基因mRNA在甲状腺良性病变组的表达明显低于正常甲状腺组（P<0.05）。免疫组化与RTPCR检测结果基本一致，CK19蛋白在乳头状癌中强烈而弥漫地表达而在良性病变中不表达或弱表达。因此，我们推测CK19基因在甲状腺癌早期发生特异性表达增高，其基因表达调控可能发生在复制或转录水平，甲状腺癌中CK19基因mRNA和蛋白表达增高可能促进肿瘤细胞的增殖和侵袭。CK19可作为区分甲状腺乳头状癌和甲状腺良性病变的一个特异性标志物。
转移和复发是影响甲状腺癌患者预后的主要因素，但目前对甲状腺癌淋巴结微转移尚无有效的检测指标。我们的研究还发现，CK19基因mRNA在有淋巴结转移的乳头状癌组的表达明显高于无淋巴结转移组，但免疫组化结果两组间无统计学差异，提示CK19基因mRNA表达增多与甲状腺乳头状癌的转移有关，是否能作为预测转移的指标还有待今后进一步研究证实。
长江大学学报（自然科学版）2009年3月综上所述，CK19基因可以作为研究、诊断甲状腺乳头状癌的一个标志物。我们的研究证明免疫组织化学方法检测CK19蛋白的表达可有效鉴别良、恶性甲状腺病变；应用RTPCR技术快速检测甲状腺乳头状癌中CK19mRNA的敏感性、特异性优于免疫组化，并对判断有无淋巴结转移和估计预后具有十分重要的意义。
【参考文献】
［1］Miettinen M，Rovatich AJ，Karkkainent P，et al.Keratin subsets in papilary and follicular thyroid lesions：A parafin section analysis with diagnostic implications[J]. Vichows Arch，1997：431437.
[2]张静，王莉. CK19、RET、Survivin在甲状腺乳头状癌及淋巴细胞性甲状腺炎中表达的意义[J].新疆医科大学学报，2008，31（9）：11541158.
[3]王新杰，李清怀. CK19、34βE12、Ecadherin在甲状腺乳头状癌组织中的表达及临床病理学意义[J].承德医学院学报，2007，24（4）：411413.
[4]朱广迎，刘德林，王绪，等.检测CK19 mRNA和MUC1 mRNA诊断非小细胞肺癌淋巴结微转移[J]. 中国肺癌杂志，2004，7(3)：226229.
[5]何春年，Lili H，Jin QCH，等. 甲状腺乳头状癌诊断与鉴别的可靠标记物[J]. 临床与实验病理学杂志，2007，23（6）：694698.
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